北京大学分生笔记4

五、利用适配子连接
适配子是人工合成的具有一个以上限制酶识别位点的短序列，它具有一个平端，可与其它DNA的平端连接，同时它还有某种限制酶的突出端，可与含互补的限制酶突出端的DNA片段连接，连接后，用适当的限制酶切割又可产生所需要的突出粘端。
第五节重组DNA导入宿主菌
体外连接的重组DNA分子必须导入适当的受体细胞中才能大量的复制、增殖和表达。根据所采用的载体的性质，将重组DNA分子导入受体可有不同的方法。
一、转化
指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。转化时，细菌必须经过适当的处理使之处于感受态－即容易接受外源DNA的状态，然后利用短暂热休克使DNA导入细菌宿主中。
此外还可用电穿孔法转化细菌，它的优点是操作简便、转化效率高、适用于任何菌株。
二、转染和感染
利用噬菌体DNA作为载体时可经两种方式导入受体菌。一种是感染，即在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌。另一种方式是转染，即在DNA连接酶作用下使噬菌体DNA环化，再象重组质粒一样地转化进受体菌。但习惯上常把以噬菌体DNA为载体构建成的重组子导入细胞的过程统称为转染。
第六节重组克隆的筛选与鉴定
基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性。通过细菌培养以及重组子的扩增，获得所需的基因片段的大量拷贝。进一步研究该基因的结构、功能，或表达该基因的产物。
一、抗药性标志的筛选
如果克隆载体带有某种抗药性标志基因如ampr或tetrr ，转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗菌素的平板上幸存并形成菌落，这样就可将转化菌与非转化菌区别开来。如果重组DNA时将外源基因插入标志基因内，该标志基因失活，通过有无抗菌素培养基对比培养，还可区分单纯载体或重组载体（含外源基因）的转化菌落。
二、β－半乳糖苷酶系统筛选
很多载体都携带一段细菌的lacZ基因，它编码β－半乳糖苷酶N-端的146个氨基酸，称为α－肽，载体转化的宿主细胞为lacZΔ15基因型，它表达β－半乳糖苷酶的C-端肽链，当载体与宿主细胞同时表达两个片段时，宿主细胞才有β－半乳糖苷酶活性，使特异的底物X-gal 变为兰色化合物，这就是所谓的α－互补，而重组子由于基因插入使α－肽基因失活，不能形成α－互补，在含X-gal的平板上，含阳性重组子的细菌为无色菌落或噬菌斑。
三、菌落快速裂解鉴定法
从平板上直接挑选菌落裂解后，直接电泳检测载体质粒大小，判断有无插入片段存在，该法适于插入片段较大的重组子初筛。
四、内切酶图谱鉴定
经初筛鉴定有重组子的菌落，小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA,用相应的内切酶切割，释放出插入片断；对于可能存在双向插入的重组子，还要用内切酶消化鉴定插入的方向。
五、通过聚合酶链反应筛选重组子
一些载体的外源DNA插入位点两侧存在特定的序列，如启动子序列等，利用这些特异性序列作为引物，对小量制备的质粒DNA进行聚合酶链反应（PCR）分析，不但可迅速扩增插入片断，判断是否阳性重组子，还可直接对插入进行DNA 序列分析。
六、菌落或噬菌斑原位杂交
它是先将转化菌落或噬菌斑直接铺在硝酸纤维素膜或琼脂平板上，再转移至另一膜上，然后用标记的特异DNA探针进行分子杂交，挑选阳性菌落。该法能进行大规模操作，一次可筛选多达5x105-5x106个菌落或噬菌斑，特别适于从基因文库中挑选目的基因。
第九章基因诊断
基因诊断是通过检测基因的存在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。
基因诊断的主要技术：
1、核酸分子杂交
2、聚合酶链反应（PCR）
3、基因芯片技术
第一节核酸分子杂交技术
核酸杂交（Nucleic acid hybridization）是指具有一定同源性的两条单链核酸在一定条件下，按碱基互补的原则重新配对形成双链的过程。
一、核酸杂交的基本原理
DNA的变性和复性：
在一定的条件（如适当的温度、有机溶剂存在等）下，DNA的双链可解开成为单链，这一过程称为DNA的变性（Denaturatioin）。高温、低盐和有机溶剂促进DNA变性。
Tm值是反映DNA的热稳定性的一个参数，称为DNA的熔化温度，系指一半的双链DNA解离成为单链时的温度。
DNA的热稳定性或Tm值直接与其碱基组成特别是GC碱基对含量有关，GC碱基对含量越高，Tm值也越高。
DNA的杂交即复性（Renaturation）是变性的单链DNA在一定的条件下（低于Tm的温度下）与其互补序列退火形成双链的过程，因此杂交与Tm值相关。
影响杂交的主要因素：
温度：一般在低于Tm约15至２５度的温度下杂交速率最快。
盐浓度：钠离子增加杂交分子的稳定性，降低钠离子浓度强烈地影响Tm值和复性速率。但当钠离子浓度超过0.4M时，对复性速度和Tm值影响不大。
甲酰胺：有机溶剂如甲酰胺能减少双链核酸的稳定性。每增加1%的甲酰胺，DNA/DNA或DNA/RNA双链的Tm值减少0.72℃。常用50%甲酰胺
硫酸葡聚糖：使杂交速率增加，但有时可能增加杂交本底。
二、核酸探针的选择和标记
核酸探针是指能与待检测的靶核酸序列互补杂交的某种已知核酸片段，它必须具有高度的特异性，并且带有某种适当的标记以便被检测。
（一）核酸探针的类型
1、克隆的DNA片段，常用cDNA探针。
2、RNA探针（Riboprobe）
RNA探针的优点是特异性高；杂交效率(灵敏度)更高。适合于Northen杂交、原位杂交等。主要缺点是不稳定，易被降解，另外其制备较困难。
3、寡核苷酸探针可用化学方法人工合成，制备较方便，但灵敏度稍差。
4、聚合酶链反应扩增产物是很好的探针来源，其优点是制备和标记相对容易。
（二）核酸标记的类型
放射性同位素目前应用最广，优点是灵敏度高，特别适用于单拷贝基因或低丰度mRNA检测，缺点是易造成放射性污染以及半衰期短，使用不便。
核酸探针标记常用的同位素有以下几种：
１、３２P：其放射性强，自显影时间短，灵敏度较高，缺点是半衰期短（14.3天），放射线散射较严重，因此对分辩率有影响。
２、 35S ：放射性较低，半衰期长（87.1天），灵敏度较高；低散射，因此在用Ｘ－光片自显影时分辩率高，特别适用于核酸序列分析和原位杂交等实验。
３、 33P ：是一种较理想的同位素，它的放射性较低，灵敏度高，分辩率好，半衰期也较长(25.4天)，适用范围较广。但价格偏高。
非同位素标记：常用地高辛或生物素系统。
优点：无放射性污染，较稳定；缺点：灵敏度、特异性稍差。
（三）核酸探针的标记
1、随机引物法（Random priming）
随机引物是人工合成的含有各种可能的排列顺序的六核苷酸片段的混合物，因此可以与任何核酸片段杂交，并作为聚合酶反应的引物。
标记酶：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段－klenow片段。
特点：所得探针的放射性比活较高，适用于大多数杂交。
2、缺刻平移法(Nick translation0
标记酶：大肠杆菌DNaseⅠ（极微量）和DNA聚合酶Ⅰ。
用缺刻平移法制备的探针较短，较适合于原位杂交。
3、RNA探针的制备和标记
RNA探针可用RNA聚合酶体外转录法制备。该方法的合成效率高，所得产物大小均一，有较高的比活，特异适合于Northern杂交和原位杂交。
4、聚合酶链反应标记DNA探针
利用Taq DNA聚合酶和标记的dNTP,sk 以少量的起始模板合成高比活的c双链或单链DNA探针。
5、寡核苷酸探针的标记
5’-端标记：T4多核苷酸激酶标记法，一般用于制备DNA序列分析时用的5’-标记的寡苷酸引物。
3’-端标记：末端转移酶法，32P-dNTP或ddNTP。
6、非同位素核酸探针标记：地高辛或生物素标记的核酸探针的制备方法和同位素探针相似。但是不能用多核苷酸激酶标记法直接对5’-端进行非同位素标记。
三、常用核酸杂交技术
滤膜杂交
固相杂交
核酸杂交原位杂交
液相杂交
滤膜杂交是指先将待检测的核酸序列结合到适当的固相支持物如尼龙膜上，然后与存在于溶液中的已标记探针进行杂交的过程。
滤膜杂交的基本过程为：
1、核酸探针的制备和标记；
2、核酸片段的凝胶电泳分离；
3、将凝胶中的核酸片段通过印迹（blot）转移到某种固相支持物上；
4、用标记的探针与被固定的靶核酸序列杂交（通过还包括预杂交）；
5、洗膜（除去未杂交的游离探针等）；
6、检测带标记的杂交分子（放射自显影或酶联反应）。
（一）斑点／狭缝印迹（Dot/slot blot）杂交：DNA或RNA样品经变性后直接点样于尼龙膜上，然后进行杂交和检测。其优点是简单、迅速，可同时做多个样品；缺点是特异性不好，有一定比例的假阳性，此外，靶核酸的分子大小难于判断。
（二） Southern印迹：指将经过电泳分离的DNA片断转移到一定的固相支持物的过程。
Southern印迹杂交的步骤如下：
1、用限制性内切酶消化大分子DNA;
2、用琼脂糖凝胶电泳对DNAa片段按分子量大小分离；
3、将DNA片段在琼脂糖凝胶电泳中变性成单链后，再转移到适当的固相支持物上并与之结合；
４、探针与膜上的DNA杂交；
５、检测。
Southern印迹杂交主要用于基因组结构分析、基因组DNA的定性和定量分析以及利用限制性片段长度多态性进行基因突变分析等。
（三） Northern印迹：是指RNA经变性凝胶电泳后，将其转移到固相支持物上，以便用杂交反应检测特定的mRNA分子的含量与大小。是基因表达研究分析的标准方法。
Nothern印迹的基本过程包括：
1、RNA的提取；
2、RNA变性电泳；
3、RNA转移和固定；
4、杂交；
5、检测。
除RNA的提取和变性胶电泳与DNA不同外，其余基本与Southern印迹相同，关键是减少实验中的RNA酶污染。
（四）核酸杂交在基因诊断中的应用
通过核酸杂交技术，可以利用带有某种标记的已知核酸片段作为探针，去检测未知核酸序列。因此，核酸杂交可用于基因鉴定和基因突变分析等领域。
1、限制性片段长度多态性（RFLP）分析
多态性（polymorphism）指基因组中特定基因座位（DNA序列）存在两种或两种以上状态（等位基因），并且其中任何一个等位基因在人群中的频率不低于1%。
限制性片段长度多态性（RFLP）是由于DNA变异（产生新的酶切位点或消除原有的酶切位点）导致在限制性核酸内切酶酶切时产生不同长度的片段。可借助southern blotting或PCR 的方法进行检测
RFLP分析与遗传病基因诊断。
人类染色体VNTR序列的RFLP分析图谱：DNA fingerprinting。
2、等位基因特异性寡核苷酸（ASO）探针杂交
寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性，因此可用人工合成的针对正常和突变等位基因的特异性寡核苷酸探针进行杂交，检测点突变。
3、基因表达分析
常用Northern blotting或原位杂交分析。
第二节聚合酶链反应（PCR）技术
一、PCR的基本原理
（一）PCR的基本过程
PCR是一种体外扩增特异DNA片段的技术。它包括下列三个基本步骤：
1、变性（Denaturation）：待扩增的DNA模板加热变性成单链；
2、退火（Annealing）：降低温度，使单链靶序列与寡核苷酸引物退火；
3、延伸（Extension）：在适当条件下，利用DNA聚合酶使引物延伸，产生新的双链。上述变性、退火、延伸步骤的重复循环，导致特异的靶序列的指数扩增。
PCR产物是介于引物的5’端之间的双链DNA片段。
（二）PCR体系中的主要成份
1、Taq DNA 聚合酶是一种耐热的DNA聚合酶，具有5’-3’DNA聚合酶活性，一般有5’-3外切酶活性，有或无3’-5’外切酶活性（校对活性），无校对活性的酶在PCR中错掺率较高。
PCR中 Taq 酶的用量一般为0.5-2.5U，过多易造成非特异性扩增，过少可能灵敏度不够。
2、寡核苷酸引物是决定PCR扩增特异性的关键。
设计PCR引物时的几条原则：
① 引物长度一般15-30 碱基，过短则特异性低；
② 避免内部二级结构；
③ G/C和A/T碱基均匀分布，G/C含量在45%-55% 之间；
④ 两个引物（特别是3’端）间不能发生互补，以免形成引物引物二聚体；
⑤ 引物的3’-端碱基一般应与模板严格配对，并且3’端为G、C或T时引发效率较高；
⑥ 引物的5’-端可添加与模板无关的序列（如限制性内切酶的识别位点、ATG起始密码子或启动子序列等）
PCR中所用引物浓度一般在0.1-0.5uM太高的引物浓度易造成非特异性扩增，太低会降低合成效率。
3、MgCl2 Mg2+浓度除影响Taq酶活性外，还影响双链DNA的Tm值，因而影响PCR的特异性和扩增效率。
PCR中的最适MgCl2浓度一般为1.5-2.5mM(注意游离Mg2+浓度还与能结合Mg2+的化合物如dNTP、EDTA 等的浓度有关。
4、脱氧核苷三磷酸（dNTP）一般采用均衡的dNTP浓度，4 种dNTP各为 200umol/L,dNTP可减少游离Mg2+，因此影响聚合酶活性和引物退火。
5、模板单、双链DNA，以及RNA经逆转录合成的cDNA。
PCR样品可以是粗制品，但不应含有核酸酶和蛋白酶及其它干扰Taq酶活性的抑制剂。
引物/模板的比率影响PCR的特异性。
(三)PCR循环参数
1、预变性（Initial denaturation）．
模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟。
2、引物退火（Primer annealing）
退火温度一般需要凭实验（经验）决定。
退火温度对PCR的特异性有较大影响。
3、引物延伸
引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。
延伸时间随扩增片段长短而定。
4、循环中的变性步骤
循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性：
变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。
5、循环数
大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。
6、最后延伸
在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。
（四）PCR中的污染和假阳性
PCR中污染主要来自
1、样品间交叉污染；
2、先前PCR产物遗留（carry-over）
二、几种常用特殊PCR技术
（一）逆转录PCR（Reverse transcription－PCR,RT-PCR）
RNA经逆转录后可作为PCR的模板.逆转录PCR（RT－PCR）常用于基因表达研究（定量PCR）和逆病毒检测．
设计RT－PCR引物时，应使引物分别位于不同的外显子中，以便区别cDNA和gDNA扩增产物。
（二）多重PCR（Multiple PCR）
在同一PCR反应体系中用多对引物（覆盖不同长度的靶序列）同时扩增。
例如用多重PCR进行DNA缺失筛选
(三) 套式PCR（nested PCR）
用第一次PCR扩增区域内部的第二对（套式）引物对第一次PCR产物再次扩增,可以增加特异性和灵敏度。
(四)非对称PCR（asymmetric PCR）
在PCR反应体系中，限制引物之一的浓度（50－100:1）进行扩增，可得到单链PCR产物,可用于制备单链测序模板或单链DNA杂交探针。
三、PCR与突变检测
通过PCR扩增片段的多态性分析有助于检测各种突变。
PCR扩增产物的多态性可分为三种类型：
1、限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism-RFLP）;
2、序列多态性(Sequence polymorphism);
3、长度多态性(Length polymorphism)
（一）PCR-RFLP分析
设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一或数个多态性的限制性内切酶识别序列，在PCR扩增后用该限制酶切割PCR产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断，该方法主要用于检测各种已知突变。
（二）PCR结合ASO探针杂交分析
ASO（Allele specific oligonucleotide）探针：等位基因特异性寡核苷酸探针，指针对各种正常和突变靶序列设计的特异性寡核苷酸探针。
1、PCR产物变性后斑点印迹至膜上，用一系列AS0探针杂交，严格控制杂交和洗膜条件、确保正常ASO探针只与正常靶序列条交，而突变ASO只与含相应突变碱基的靶序列杂交。
2、另一种方法是将ASO探针固定在膜上，然后与生物素标记的PCR产物杂交-反向斑点杂交（reverse dot－blot），这样一次杂交可完成多个探针检测。
上述方法适用于基因组中某些固定位点上的已知序列差异的检测，如癌细胞中的ras突变，HLA typing等。

（三）等位基因特异性扩增（A11eles specific amplification，ASA）-又称扩增阻碍突变系统(Amplification refractory mutation system，ARMS)
利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性 PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，从而检测出突变，该法省去了探针杂交操作。
（四）PCR-SSCP分析
单链DNA在中性条件下，由于碱基配对等分子内相互作用而具有复杂的折叠构象，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，其迁移率除与长度有关外，还与其构象有关。DNA的突变造成DNA片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同—单链构象多态性（Single strand conformation polymorphism，SSCP），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链得以分离。
PCR一SSCP的步骤：PCR扩增→产物热变性成单链→非变性PAGE→显示（放射自显影或银染等）
PCR－SSCP是检测点突变的简便灵敏方法，已用于多种遗传病、肿瘤中原癌基因和抑癌基因的突变分析，对＜200bp片段其灵敏度较好，靶序列增长时其灵敏度下降（一般175-345nt）。
（五）扩增片段长度多态性（Amp-FLP）
VNTR、STR等重复序列，因重复单位数目的不同而呈现高度多态。因此利用重复序列两侧的特异性引物进行PCR扩增，所得扩增片段具有高度多态性，这些不同长度的等位片段可用PAGE分离。
（六）PCR直接测序
DNA序列分析是检测基因突变最直接最可信的方法，它不仅可确定突变的部位，还可确定突变的性质。PCR直接测序是指对PCR产物直接进行序列分析，而不是先将DNA待测片段克隆于测序载体上，这可大大的简化操作步骤。
PCR产物测序常采用循环测序法（cycle sequencing）：在PCR反应体系中同时将ddNTP加入，并利用同位素或荧光素标记的引物引导扩增，使模板的扩增与测序同时进行。应用PCR测序有以下优点：模板需要量小；方法简便，易自动化；测序效率高。

四、PCR在基因诊断中的应用
（一）遗传病的基因诊断
目前已有近百种遗传病可用PCR技术进行诊断和产前诊断。用PCR对遗传病进行诊断的前提是对致病基因的结构必须部分或全部清楚。
.如利用PCR-RFLP或Amp-FLP对遗传病家系进行连锁分析，进而作出基因诊断。
（二）传染病诊断
PCR已应用于多种病原体的特异性检测和鉴定
1、病毒：如HBV，HCV，HIV，HPV等。
2、致病菌：如淋球菌、结核杆菌、军团菌、幽门螺杆菌、肺炎支原体等；
（三）肿瘤基因诊断
1、原癌基因和抑癌基因突变，如ras,p53；癌基因扩增和表达分析。
2、利用微卫星不稳定性，直接诊断肿瘤，如膀胱癌等；
3、分析白血病（如CML）中异常染色体易位，检测微小残留病变（Minimal residual disease，MDR）
4、肿瘤多药耐药性（multi-drug resistance,MDR）检测
5、端粒酶活性检测
第三节基因芯片技术
基因芯片�*****ene chip/DNA chip）又称为DNA微矩阵（DNA Microarray），是包被在固相载体上的高密度DNA的微阵列。
一、基因芯片的类型：
1、寡核苷酸芯片：采用固相原位合成技术制备的，或用传统方法合成后再固定于芯片上的寡核苷酸探针阵列�*****enechip, Affymatrix,Inc）。
2、 DNA微矩阵（DNA Microarray）：将DNA探针通过自动化点样技术固定于特定的固相支持物如玻璃表面，然后再与靶序列杂交。
二、基因芯片技术的原理
DNA芯片技术是将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段有规律地排列固定于支持物（如膜、硅片或玻璃片）上，然后通过类似核酸杂交的的方法与待测的标记样品按碱基配对原则进行杂交，再通过检测系统对其进行扫描，并用相应软件对信号进行比较和检测，得到所需的生物信息。其特点是可进行基因的高通量、大规模、平行化、集约化的信息处理和功能研究。
用DNA微矩阵进行基因表达分析的步骤
1、分离（待比较的）不同组织或细胞的mRNA,逆转录法制备带不同荧光标记的cDNA探针；
2、混合探针，并与microarray杂交，洗涤除去未结合探针。
3、用特有波长的激光扫描芯片，并用共聚焦显微镜检测各探针的荧光，各element的相对荧光强度反映特异mRNA的相对丰度。
三、基因芯片技术的应用
1、疾病诊断（遗传病、肿瘤和病原体诊断）
2、新药筛选和毒理学研究
3、突变/多态性检测
单核苷酸的多态性( single nucleotide polymorphism, SNP)。
4、基因表达分析
5、发现新基因
四、表达谱基因芯片的特点及其应用
利用基因芯片可进行高通量基因表达平行分析，是基因功能研究的重要手段。对来源于不同个体（正常人与患者）、不同组织、不同细胞周期、不同发育和分化阶段、不同病变、不同刺激（包括不同诱导、不同治疗阶段）下的细胞内的mRNA或逆转录后产生的cDNA与表达谱基因芯片进行杂交，可以对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断，迅速将某个或几个基因与疾病联系起来，极大地加快这些基因功能的确立，同时进一步研究基因与基因间相互作用的关系。
采用表达谱基因芯片研究基因表达与传统的Northern Blot相比有许多重要的优点：
1、检测系统的微型化，对样品等需要量非常小
2、同时研究上万个基因的表达变化，研究效率明显提高
3、能更多地揭示基因之间表达变化的相互关系，从而研究基因与基因之间内在的作用关系
4、检测基因表达变化的灵敏度高，可检测丰度相差几个数量级的表达情况
5、节约费用和时间
Further Readings
1. Ekins R. and Chu F.W. Microarrays: their origins and applications. Trends in Biotechnolology, 1999, 17, 217-218.
2. Sinclair, B. Everything's Great When It Sits on a Chip - A bright future for DNA arrays, The Scientist, 1999 May 24, 13(11), 18-20.
3. Nature Genetics published a special issue (January 1999 Supplement), The Chipping Forecast. It's a collection of more than 10 reviews (60 pages) on different aspects of microarray analysis. All the reviews are freely available online.
4. Schena, M., Heller, R.A., Theriault, T.P., Konrad, K., Lachenmeier, E., and Davis, R.W. Microarrays: biotechnology's discovery platform for functional genomics. Trends in Biotechnology 1998, 16, 301-306.
5. Service, R.F. Microchip arrays put DNA on the spot. Science 1998, 282(5388), 396-399.
6. Ramsay, G. DNA chips - states-of-the-art. Nature Biotechnology 1998, 16(1), 40-44.
7. Marshall, A.; Hodgson, J. DNA chips - an array of possibilities. Nature Biotechnology 1998, 16(1), 27-31.

评价一下你浏览此帖子的感受

分享到： QQ空间新浪微博腾讯微博人人网网易微博

回复引用

举报顶端

上一主题下一主题

考博论坛 » 考博资料供应区

http://freekaobo.com
访问内容超出本站范围，不能确定是否安全
继续访问	取消访问

快速回复
	限 100 字节进入高级模式加粗字体颜色背景颜色插入链接图片验证问题: 2+6=? 正确答案:8 按"Ctrl+Enter"直接提交	上一个下一个