@HE<\Z{ KI
5/R
~<z
d*x&Uh[K
一、名解（3*10） +&r=XJ5:`p
WDI3*
1. 冈崎片段 在DNA不连续复制过程中，沿着后随链的模板链合成的新DNA片段，其长度在真核与原核生物当中存在差别，真核生物的冈崎片段长度约为100～200核苷酸残基，而原核生物的为1000～2000核苷酸残基。 a4XK.[O
cv;2zq=T
2.应答元件 应答元件(response element)是位于基因上游能被转录因子识别和结合，从而调控基因专一性表达的DNA序列，如热激应答元件(heat shock response element，HSE)、金属应答元件(metal response element，MRE)、糖皮质激素应答元件(glucor-ticoid response element，GRE)和血清应答元件(serum response element，SRE)等。 tr58J% Mu
wlQ
@3RN>
3.顺式作用元件和反式作用因子 顺式作用元件(cis-actingelement)存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的DNA序列。顺式作用元件包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等，它们的作用是参与基因表达的调控。顺式作用元件本身不编码任何蛋白质,仅仅提供一个作用位点，要与反式作用因子相互作用而起作用。反式作用因子(trans-acting factor) 是指能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上参与调控靶基因转录效率的蛋白质。 5&.I9}[)j
]@m`bs_6
4.基因扩增 某个或某些基因的拷贝数选择性增加的现象。这种增加可以发生在细胞或组织内，也可以在体外(试管中)或在细胞或组织中。这种增加一般与基因组的其他基因的增加不成比例，如编码核糖体核糖核酸(rRNA)的基因在爪蟾卵母细胞成熟中的扩增，原来一组大约500拷贝的rRNA基因可以扩增大约4000倍，达到200万个拷贝数。基因扩增在癌细胞中也发挥作用。 V/xjI< ,
Fr-Vq = j&
5.辅阻遏蛋白 （trpR基因突变常引起trp mRNA的永久型合成，该基因产物因此被称为辅阻遏蛋白(aporepressor)。除非培养基中有色氨酸，否则这个辅阻遏蛋白不会与操纵区结合。辅阻遏蛋白与色氨酸相结合形成有活性的阻遏物，与操纵区结合并使之关闭转录trp mRNA。） w4FYd
MAp#1+k
6.klenow片段 E.coli DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端605个氨基酸残基片段。该片段保留了DNA聚合酶I的5ˊ-3ˊ聚合酶和3ˊ-5ˊ外切酶活性，但缺少完整酶的5ˊ-3ˊ外切酶活性。 TEla?N
]x66/O\0u
7.SNP （单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。） |n;5D,r0C
+Ht(_+To1
8.RNA interference 与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象。其作用机制是双链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。已经发展成为基因治疗、基因结构功能研究的快速而有效的方法。 a]J>2A@-I
~i.rk#{?D
9.MALDI-TOF（MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱, 英文名Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry）是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，其无论是在理论上还是在设计上都是十分简单和高效的。仪器主要由两部分组成：基质附助激光解吸电离离子源（MALDI）和飞行时间质量分析器（TOF）。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。因此它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比 ，检测离子。MALDI-TOF-MS具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段，并正扮演着越来越重要的作用。） #=72 /[
7q:;3;"9
10. co-immunoprecipitation "([ lkn
AF,
;3G
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白体内是否存在相互作用；也可用于检测特定蛋白的新的结合蛋白。 Od~ e*gA8
)(rr1^Xer
二、问答 2Ima15^+ F
7q{yLcC"
1. 真核细胞组蛋白的特性。15分（组蛋白是存在于内的与DNA结合的碱性蛋白质，染色体中组蛋白以外的成分称非组蛋白。绝大部分非组蛋白呈酸性，因此也称酸性蛋白质或剩余蛋白质。组蛋白于1834年由德国科学家A.科塞尔发现。 (,|eE)+
- X3CrW
组蛋白对染色体的结构起重要的作用。染色体是由重复单位──核小体组成。每一核小体包括一个核心8聚体（由4种核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4的各两个单体组成）；长度约为200个碱基对的(DNA)；和一个单体组蛋白H1。长度约为140个碱基对的DNA盘绕于核心8聚体外面。在核心8聚体之间则由长度约为60个碱基对的DNA连接。这种DNA称为“接头”DNA。 <dAxB$16sT
#G fM^sK
组蛋白的组分 几乎所有真核细胞染色体的组蛋白均可分成5种主要的组分,分别用字母或数字命名，命名方法也不统一,如H1或称F1,Ⅰ;H2A或称F2A2,Ⅱb1；H2B或称F2B，Ⅱb2；H3或称F3，Ⅲ；H4或称F2A1,Ⅳ。有核的红细胞或个别生物体中,还存在特别的组蛋白成分,红细胞中为H5或F2C，Ⅴ，鲑鱼组织中为H6或T。H2A、H2B、H3、H4组成核小体的核心，也称核心组蛋白。根据组蛋白的一级结构，又可将它们分为3种类型:赖氨酸含量特别丰富的组蛋白(H1);赖氨酸含量较丰富的组蛋白（H2A和H2B）;精氨酸含量丰富的组蛋白（H3和H4）。从整体来说，组蛋白在进化过程中保守性很强。其中H1变化较大，H3和H4变化最小。如对小牛胸腺的5种组蛋白,豌豆苗组蛋白的H3、H4和兔胸腺组蛋白H1等的一级结构比较中发现，小牛胸腺和豌豆苗的组蛋白H4间只在60位和77位上的两个氨基酸残基不同。但已知的真菌和原生动物的组蛋白的部分一级结构和动、植物的组蛋白间的差异较大。 ]AZCf`7/?
@LY[kt6o
组蛋白合成后的修饰 这是形成组蛋白各组分微不均一性的主要原因。修饰的方式有：①乙酰化。有两种，一种是H1、H2A、H4组蛋白的氨基末端乙酰化，形成-乙酰丝氨酸，组蛋白在细胞质内合成后输入细胞核之前发生这一修饰。二是在H2A、H2B、H3、H4的氨基末端区域的某些专一位置形成-乙酰赖氨酸。②磷酸化。所有组蛋白的组分均能磷酸化，在期间,H1的1～3个丝氨酸可以磷酸化。而在时期,H1有3～6个丝氨酸或苏氨酸发生磷酸化，其他四个核心组蛋白的磷酸化可以发生在氨基末端区域的丝氨酸残基上。组蛋白的磷酸化可能会改变组蛋白与DNA的结合。③甲基化。仅发现于H3的9和27位和H4的20位的赖氨酸，鸭红细胞组蛋白H1和H5的组氨酸。④ADP-核糖基化。组蛋白H1、H2A、H2B及H3和多聚ADP-核糖的共价结合，ADP-核糖基化被认为是在真核细胞内启动复制过程的扳机。 Nr}O6IJ>Sg
Rl_1g`84
2. 真核与原核在基因转录、翻译及DNA空间结构方面的差异。18分 @i#=1)Z e
#T V #*
原核生物DNA的高级结构绝大部分原核的DNA都是共价封闭的环状双螺旋分子在细胞内进一步盘绕，并形成类核结构，以保证其以较致密的形式存在于细胞内在细菌基因组中，超螺旋可以相互独立存在2.真核生物DNA的存在形式 在真核生物，DNA以非常致密的形式存在于细胞核中在细胞周期的大部分时间里以分散的染色质形式出现在细胞分裂期形成高度组织有序的染色体 YRv}w3yQ
crx%;R
3. 新生的多肽链如何加工成有活性的蛋白质。12分 /( 9.Fqe(
e`+ej-o,
4. 已知一个拟南芥EMS诱变突变体有明显性状，请简述怎样才能获得目的基因及该基因调控目标性状的分子机制。25分 iG"1~/U
x7i,jMR
通过图位克隆的方法对ems15突变体进行基因定位。利用拟南芥Landsberg erecta(Ler)和Columbia(Col)生态型之间DNA片段长度的多态性,设计分子标记对突变体与Col杂交的遗传群体进行基因定位。通过初定位将突变基因定在第四条染色体上的FCA6和F7K2两个分子标记之间;通过精细定位将定位区间缩至分子标记F28J12(4)和F28A21(7)之间约49.6kb范围内,该区间共有13个基因, 32pPeYxB!-
K .C x 9
三、突变体突变基因的定位与克隆 6BZi4:PDx
Fh&USn"
在获得具有目的性状的突变体后，可利用该突变体克隆与目的性状相关的功能基因。 M5x MTP-
7.+vp@+
1. 利用T-DNA插入突变体的基因克隆 5 o[E8
c 8
W Dr=+=Zj
由于T-DNA插入诱变的过程本身也是对基因进行标记（gene-tagging）的过程，所以一旦得到具有理想目的性状的突变体，对该突变基因的克隆工作将较为简单、快捷。图21-2表示利用T-DNA插入突变体克隆突变基因的过程。利用筛选获得的具有目的性状的突变体提取总DNA，以此总DNA为模板，以插入的T-DNA两端的已知序列为引物进行反向PCR扩增，获得含有外源DNA片段的插入位点左右两端的突变基因片段。在拟南芥基因组测序工作完成以前，人们在获得插入位点左右两端的突变基因片段后，大多是以此为探针自基因库中筛选相对应的基因克隆。但在拟南芥基因组的全序列已经公布之后，人们在获得插入位点左右两端的突变基因片段后的工作变得更加简单，可将插入位点两端的突变体植株DNA片段先进行测序，然后将其序列直接与拟南芥的全序列数据库进行比较，即可方便地获得突变基因的全长序列。 M+)ENv e
k9&W0$
I#
2. 利用化学诱变突变体进行基因克隆 :c(I-xi
f
}h|HT
利用化学诱变方法获得的突变体克隆目的基因的过程较为繁杂、工作量也十分庞大。基本过程包括：（1）作图群体的构建；（2）突变基因的染色体定位；（3）利用染色体步移法逐步逼近目的基因；（4）利用基因转移方法克隆目的基因。 }0>\
%C
qZlL6
（1）作图群体的构建（以构建不同生态型杂交的F2代群体为例）：首先将突变体与不同生态型的野生拟南芥植株进行杂交，如果突变体的亲本是 Columbia生态型（简称C型），则可用野生 Landsburg生态型（简称L型）与突变体进行杂交，然后利用F2代筛选仍然表现突变性状的植株构成作图群体。对于基因的粗定位来说，一般有200至300株F2代构成的作图群体就可以完成，但对于较精细的定位来说，则需构建数量较大的F2代作图群体（如1000株或甚至更多）。 g>a%
gVly
@HY P_hR
（2）突变基因的染色体定位：在5条染色体上选择若干个已知的分子标记位点用于基因的染色体粗定位。至于应该选择那一类分子标记进行基因的染色体定位，较早的时候多用RFLP和RAPD标记。但近年来更为简单快捷的拟南芥的SSLP和CAPS标记发展较快，到2001年底，已经公布的SSLP标记已经超过1万，而且新的SSLP和CAPS标记还在陆续被报导，所以使用后两种标记方法的工作日渐增多。当然，还有近年来迅速发展起来的SNP标记（有关各种分子标记的方法及优缺点比较请读者参考有关文献或书籍）。在实际的研究工作中，往往要根据实际情况交叉使用不同的分子标记。在确定分子标记的方法后，可以先在5条染色体上根据一定间隔选择若干标记对目的基因进行搜寻定位。如以间隔20个厘摩（centimorgan, cM）来选择已知的分子标记，假设目的基因位于两个已知标记之间，则目的基因与已知标记之一的距离应小于或等于10个厘摩。利用上述以突变体与不同生态型的野生拟南芥植株进行杂交所获得的F2代作图群体对目的基因（突变基因）进行染色体定位的基本原理是：不同生态型拟南芥（如C型和L型）之间的基因序列有所不同，通过杂交所获得的作图群体由于染色体的重组与交换获得了一定的多态性（即含有另一生态型基因组的部分序列）。目前可利用的多数分子标记（如SSLP或CAPS标记）的PCR扩增产物或扩增后的酶切产物的长度在C型和L型拟南芥之间有明显差异（即所谓多态性）。理论上讲，如果目的基因距离被检测的某一分子标记的遗传距离愈远，则在此区间内发生重组交换的频率就愈高；而利用该已知标记为引物、以作图群体植株的DNA为模板所获得的扩增产物中同时出现两种生态型DNA片段的几率也就愈大。根据此原理，以所选择的已知分子标记为引物对F2代作图群体植株DNA分别进行PCR扩增及产物电泳检测，根据产物多态性出现的几率可以计算出目的基因与已知标记的遗传距离，从而将目的基因大致定位在染色体的某一区段内。所用的作图群体的数量愈大，则目的基因的定位愈准确精细。 cK IA.c}N
a4]=4[(iu>
（3）利用染色体步移法逐步逼近目的基因：在已经将目的基因定位在染色体的某一区段之后，由于该区段内可能仍包含许多基因，所以需要进一步的缩小突变基因存在的范围，直至使克隆目的基因成为可能。逐步逼近目的基因、将目的基因存在的范围尽可能地缩小的过程被称为“染色体步移”（chromosome walking）。在基因粗定位的基础上，如果在已经使用的两个分子标记之间与目的基因更为接近的区域还有已知的分子标记，则可以直接利用这些标记进行染色体步移，直至没有已知的分子标记可以利用。接下来则需自行寻找新的分子标记。在拟南芥基因组全序列已经公布之后，寻找新的分子标记的工作已经变得相对简单了。可以根据目的基因附近的DNA序列，根据分子标记引物设计的原则自行设计一些引物继续进行染色体步移，直到将目的基因定位在很小的一段DNA序列范围内。 z)R\WFBW
s -F3(mc(
（4）利用基因转移方法克隆目的基因：在将目的基因定位在很小的一段DNA序列范围内之后，如何克隆目的基因则需视具体情况而定。最幸运的情况是，在含有目的基因的DNA序列范围内只有一个基因编码区域，则此编码区即为该目的基因序列。但更常见的情况是在含有目的基因的DNA序列范围内包含多个编码区域，这就需要对该段DNA进行亚克隆，然后分别将亚克隆转移到突变体株中进行性状恢复实验，能使突变体性状恢复的亚克隆DNA片段含有目的基因的编码区。 L9l]0C37e
Zf S"
